שליטתו של ארסמוס ביוונית ובלטינית אפשרה לו להשוות בין תרגומי מקרא לטיניים, כגון הוולגטה, לבין כתבי יד יווניים קדומים של הברית החדשה (הנקראת גם כתבי־הקודש היווניים). הוא הגיע למסקנה שמן ההכרח שכל אדם ירכוש ידע מקראי. לכן הוא הצהיר שיש לתרגם את כתבי־הקודש לשפות השגורות בימיו.‏

ארסמוס האמין שצריכה להתרחש רפורמה פנימית בכנסייה הקתולית משום שלדידו הדת המשיחית צריכה להיות דרך חיים ולא להסתכם בטקסים חסרי משמעות. כתוצאה מכך, כאשר החלו הרפורמאטורים במחאותיהם ודרשו שיתחוללו שינויים בתוך הכנסייה הרומית, הוא עורר את חשדם של גורמים קתוליים.‏

בכתביו חשף ארסמוס בצורה סטירית את מעשיהם הפסולים של אנשי הכמורה, את סגנון חייהם הראוותני ואת שאיפותיהם של האפיפיורים שתמכו בלהט במלחמות. הוא יצא חוצץ נגד אנשי הכמורה המושחתים שניצלו את המאמינים באמצעות מסורות כנסייתיות כמו וידוי, פולחן קדושים, צום ועלייה לרגל. הוא גם התנגד למנהגים כגון מכירת כתבי מחילה ופרישות כפויה.‏

בשנת 1516 הוציא ארסמוס מתחת ידו את המהדורה הראשונה שלו של הברית החדשה ביוונית — הנוסח המודפס הראשון בשפת המקור של כתבי־הקודש היווניים שאי פעם יצא לאור. נוסח זה כלל הערות ותרגום לטיני פרי עטו לכתבי־הקודש היווניים שהיה שונה מתרגום הוולגטה. לאורך תקופה מסוימת הוא ערך תיקונים בתרגומו, והתוצר המוגמר היה שונה אף יותר מנוסח הוולגטה הלטינית.‏

אחד ההבדלים נגע ליוחנן א’. ה’:7‏. כדי לתמוך בדוקטרינת השילוש הלא־מקראית שובצה בוולגטה תוספת מאוחרת המכונה קוֹמָה יוֹהַנַאוּם ‏(comma Johanneum), וזו לשונה: ”בשמיים האב, הדבר ורוח הקודש ושלושתם אחד המה”. ארסמוס השמיט את המילים הללו משתי מהדורותיו הראשונות של הברית החדשה משום שהן לא הופיעו באף אחד מכתבי היד היווניים שהיו ברשותו. אולם מאוחר יותר לחצה עליו הכנסייה לכלול אותן במהדורה השלישית שלו.‏

המהדורות המתוקנות של הברית החדשה ביוונית שהוציא ארסמוס מתחת ידו סיפקו בסיס לתרגומים משופרים לשפות אירופיות. מרטין לותר, ויליאם טינדל, אנטוניו ברוצ’ולי ופרנסיסקו דה אנתינס נעזרו בהן כשתרגמו את כתבי־הקודש היווניים לגרמנית, אנגלית, איטלקית וספרדית בהתאמה.‏

ארסמוס חי בתקופה מכרעת של סערה דתית, והנוסח שלו לברית החדשה ביוונית נחשב לכלי יקר מאין כמוהו בעיני הרפורמאטורים הפרוטסטנטים. היו שראו בארסמוס רפורמאטור, אך דעתם השתנתה כשהחלה הרפורמציה והתנהלו בעקבותיה פולמוסים תיאולוגיים גדולים. באותה עת הבהיר ארסמוס שהוא אינו מוכן לתמוך באף צד. מעניין לציין שלפני למעלה מ־100 שנה כתב החוקר דיוויד שַף שארסמוס ”מת בבדידות, ללא כל שייכות דתית. הקתולים לא היו מוכנים להכיר בו, והפרוטסטנטים לא יכלו להכיר בו”.‏