Számos elképzelés született arról, hogy mi okozhatja a fertőzést, de a rejtélyt nem tudták megfejteni. A halálozási arány csökkentésére tett kísérletek hiábavalónak bizonyultak. Semmelweiset nagyon felkavarta a lassú, gyötrelmes halált szenvedő édesanyák látványa, ezért elhatározta, hogy kideríti, mi okozza a fertőzést, és hogy hogyan lehet megelőzni.

A kórháznak, amelyben dolgozott, két szülészeti osztálya volt, és az egyiken furcsa módon jóval több édesanya halt meg, mint a másikon. A két osztály között az egyetlen különbség az volt, hogy az egyiken orvostanhallgatókat oktattak, a másikon szülésznőket. Miért tért el ennyire a halálozási arány? Hogy Semmelweis megoldja a rejtélyt, módszeresen kizárta a fertőzés lehetséges okait, mégsem jutott eredményre.

Ám 1847 elején kezdett valamit sejteni. Jakob Kolletschka, a kollégája és barátja meghalt vérmérgezésben, miután egy boncolás során megsérült. Miközben Semmelweis olvasta Kolletschka boncolási jegyzőkönyvét, észrevette, hogy a kórbonctani lelete bizonyos mértékben azonos a gyermekágyi lázban elhalt anyák kórbonctani elváltozásaival. Semmelweis úgy gondolta, hogy amit ő a boncolt testről származó mérgező anyagnak nevezett,  az fertőzhette meg a várandós asszonyokat, és okozhatta a gyermekágyi lázat. Az orvosok és az orvostanhallgatók gyakran boncoltak, mielőtt a szülészeti osztályra mentek, és akaratlanul is átvitték a fertőzést az anyákra, miközben vizsgálták őket, vagy éppen világra segítették a gyermekeiket. A másik osztályon alacsonyabb volt a halálozási arány, mert azok, akik szülésznőnek tanultak, nem végeztek boncolást.

Semmelweis azonnal bevezette az alapos kézmosást, ami magában foglalta, hogy az orvosoknak klórmeszes oldattal is fertőtleníteniük kellett a kezüket, mielőtt a várandós asszonyokat megvizsgálták. Az eredmény rendkívüli volt: a halálozási arány az áprilisi 18,27 százalékról 0,19 százalékra csökkent az év végére.

Nem mindenki örült Semmelweis sikerének. Az eredményei aláásták a felettese elméleteit a gyermekágyi láz kiváltó okáról. Ezenkívül a felettesét Semmelweis hajthatatlan magatartása is bosszantotta. Semmelweis végül elvesztette a bécsi állását, és visszatért Magyarországra. A Rókus-kórház szülészeti osztályán kezdett dolgozni, ahol a módszerének köszönhetően 1 százalék alá csökkent a gyermekágyi láz miatti elhalálozási arány.

1861-ben Semmelweis kiadta A gyermekágyi láz kóroktana, fogalma és megelőzése című művét. Sajnos még évekig nem ismerték el a felfedezésének jelentőségét, és addig nagyon sokan szenvedtek gyötrelmes halált értelmetlenül.

Semmelweisre idővel már úgy tekintettek, mint aki a fertőtlenítő eljárás egyik szellemi atyja. A munkássága megerősítette azt a tényt, hogy a mikroszkopikus anyagok fertőzést okozhatnak. Semmelweisnek fontos szerepe volt a csíraelmélet felállításában, amelyről azt mondják, hogy „a legjelentősebb mértékben mozdította előre az orvostudományt és az orvoslást”. Érdekes, hogy a mózesi törvény, amely része lett a Bibliának, már több mint 3000 évvel korábban egyértelmű útmutatást adott arra, hogyan kell bánni a holttestekkel.