Erasmus’ beheersing van het Grieks en het Latijn stelde hem in staat Latijnse Bijbelvertalingen, zoals de Vulgaat, te vergelijken met vroege Griekse manuscripten van de christelijke Griekse Geschriften, het zogenaamde Nieuwe Testament. Hij raakte ervan overtuigd dat kennis van de Bijbel van levensbelang was. Daarom verklaarde hij dat de Heilige Schrift vertaald zou moeten worden in de talen die op dat moment gesproken werden door de gewone man.

Erasmus vond dat de katholieke kerk van binnenuit vernieuwd moest worden. Volgens hem zou het christelijke geloof een manier van leven moeten zijn en niet alleen maar het uitvoeren van moeilijk te begrijpen rituelen. Daarom kwam Erasmus, toen hervormers begonnen te protesteren en veranderingen binnen de kerk eisten, onder verdenking van de kerk te staan.

In zijn werken legde Erasmus op satirische wijze allerlei misstanden in de kerk bloot: misbruik door geestelijken, hun overdadige levensstijl en de ambitie van pausen die oorlogen toejuichten. Hij had er moeite mee dat corrupte geestelijken gewone kerkgebruiken — de biecht, heiligenverering, het vasten en pelgrimstochten — gebruikten om gelovigen uit te buiten. Hij was het ook niet eens met praktijken als de verkoop van aflaten en het gedwongen celibaat.

In 1516 publiceerde Erasmus zijn eerste editie van het Nieuwe Testament in het Grieks — de eerste gedrukte versie van de christelijke Griekse Geschriften die ooit is uitgegeven. Erasmus’ werk bevatte ook aantekeningen en zijn eigen Latijnse vertaling van de christelijke Griekse Geschriften, die afweek van de Vulgaat. In de jaren daarna bleef hij zijn versie herzien, zodat de verschillen met de Latijnse Vulgaat uiteindelijk dramatische vormen aannamen.

Eén van de afwijkingen betrof 1 Johannes 5:7. Ter ondersteuning van het onbijbelse dogma van de Drie-eenheid waren er aan de Vulgaat enkele woorden toegevoegd, een vervalsing die bekendstaat als het comma Johanneum. Er stond: ‘in de hemel, de Vader, het Woord en de Heilige Geest: en deze drie zijn één’. Erasmus liet die woorden echter weg in zijn eerste twee edities van het Nieuwe Testament, omdat ze niet voorkwamen in de Griekse manuscripten die hij had geraadpleegd. Onder druk van de kerk nam hij ze later toch op in zijn derde editie.

Verbeterde uitgaven van het Griekse Nieuwe Testament van Erasmus vormden de basis voor betere vertalingen in Europese talen. Maarten Luther, William Tyndale, Antonio Bruciolo en Francisco de Enzinas maakten er gebruik van om de Griekse Geschriften respectievelijk te vertalen in het Duits, Engels, Italiaans en Spaans.

Erasmus leefde in een tijd vol religieuze oproer. Zijn Griekse Nieuwe Testament werd door de protestantse hervormers beschouwd als een hulpmiddel van onschatbare waarde. Erasmus zelf werd door sommigen beschouwd als hervormer — totdat de Reformatie in alle hevigheid losbarstte. Toen dat gebeurde, weigerde hij partij te kiezen in de grote theologische debatten. Zijn opstelling werd ruim een eeuw geleden treffend beschreven door de geleerde David Schaff: ‘Erasmus stierf als eenling zonder partij. De katholieken wílden hem niet voor zich opeisen; de protestanten kónden het niet.’