Erasmus’ gode gresk- og latinkunnskaper gjorde at han kunne sammenligne latinske bibeloversettelser, for eksempel Vulgata, med tidlige greske håndskrifter til De kristne greske skrifter (Det nye testamente). Han ble overbevist om at det var helt nødvendig å ha bibelkunnskap. Han mente derfor bestemt at Bibelen burde bli oversatt til språk som var vanlige på den tiden.

Erasmus tok til orde for en indre fornyelse av den katolske kirke, for han mente at kristendommen burde være en levemåte og ikke bare dreie seg om å følge meningsløse ritualer. Da reformatorer begynte å protestere og forlange en forandring i den katolske kirke, ble Erasmus derfor sett på med mistenksomhet av ledere i kirken.

I sine skrifter avslørte Erasmus i et satirisk språk presteskapets urette handlinger og overdådige livsstil og kritiserte det at paver støttet kriger. Han var uenig med korrupte prester som brukte kirkeskikker – som syndsbekjennelse, helgendyrkelse, faste og pilegrimsreiser – til å utnytte de troende. Han var også imot kirkens avlatshandel og dens krav om sølibat.

I 1516 utgav Erasmus sin første utgave av Det nye testamente på gresk – tidenes første trykte utgave av De kristne greske skrifter på originalspråket. Dette verket omfattet Erasmus’ kommentarer og også hans egen oversettelse av De kristne greske skrifter til latin, som avvek fra den latinske teksten i Vulgata. Etter hvert utgav han revisjoner av sin utgave av Det nye testamente, og sluttproduktet avvek enda mer fra teksten i Vulgata.

En av forskjellene var i 1. Johannes 5:7. Til støtte for den ubibelske treenighetslæren var det i dette skriftstedet i Vulgata blitt satt inn noen ekstra ord, en tekstforfalskning som kalles Comma Johanneum. Den uekte tilføyelsen lyder: «I himmelen: Faderen, Ordet og Den Hellige Ånd, og disse tre er ett.» Men Erasmus lot være å ta med disse ordene i sine to første utgaver av Det nye testamente, siden de ikke stod i noen av de greske håndskriftene han brukte som grunnlag for sin oversettelse. Senere ble han presset av kirken til å ta dem med i den tredje utgaven.

Erasmus’ forbedrede utgaver av Det nye testamente på gresk ble grunnlaget for bedre oversettelser til forskjellige europeiske språk. Martin Luther, William Tyndale, Antonio Brucioli og Francisco de Enzinas brukte dem da de oversatte De greske skrifter til henholdsvis tysk, engelsk, italiensk og spansk.

Erasmus levde i en periode med stor religiøs uro. De protestantiske reformatorene så på hans greske utgave av Det nye testamente som en uvurderlig hjelp, og noen betraktet Erasmus selv som en reformator, men bare fram til reformasjonen virkelig skjøt fart. Da nektet han å ta parti i de store teologiske debattene som fulgte. Interessant nok skrev kirkehistorikeren David Schaff for cirka hundre år siden at Erasmus «døde i isolasjon, uten noen religiøs tilknytning. Katolikkene ville ikke hevde at han var en av dem, og protestantene kunne ikke».