Erasmus bemästrade både grekiska och latin, och han jämförde olika latinska bibelöversättningar, till exempel Vulgata, med tidiga grekiska handskrifter till Nya testamentet. Han hade blivit övertygad om att Bibelns budskap var livsviktigt, och därför föresatte han sig att översätta de heliga skrifterna till andra språk som talades på hans tid.

Erasmus tyckte att sann kristendom handlar om hur man lever sitt liv, inte om tomma ritualer. Han hävdade att kyrkan behövde förändras, och när reformatorerna började ställa krav och göra sina röster hörda började den katolska kyrkan se med oblida ögon på honom.

I sina skrifter avslöjade Erasmus prästerskapets moraliska övertramp, deras överdådiga livsstil och påvarnas förmätna stöd till krig. Med bitande ironi angrep han korrupta präster som höll de stackars troende under kontroll genom bikt, helgondyrkan, fasta och pilgrimsfärder. Han kritiserade också sådana kyrkliga företeelser som avlatsbrev och påtvingat celibat.

År 1516 publicerades Erasmus första utgåva av Nya testamentet på grekiska. Det var första gången Nya testamentet gavs ut på grekiska i tryckt form. Förutom den grekiska översättningen innehöll utgåvan kommentarer och Erasmus latinska översättning av Nya testamentet, som skilde sig från Vulgata. Han fortsatte sitt arbete och reviderade sin översättning, och slutprodukten blev en text med ännu mer markanta skillnader från Vulgata.

En av de stora skillnaderna sågs i 1 Johannes 5:7. För att få den obibliska treenighetsläran att stämma överens med Bibeln hade ett falskt inskott, känt som comma johanneum, lagts till i Vulgata. Det löd: ”i himlen: Fadern, Ordet och den heliga anden; och dessa tre är ett”. Men Erasmus fann inga belägg för de orden i någon av de handskrifter han utgick ifrån, och därför tog han inte med dem i sina två första utgåvor av Nya testamentet. Han pressades dock av kyrkan att ta med dem i sin tredje utgåva.

Reviderade utgåvor av Erasmus verk lade grunden för bättre översättningar till flera europeiska språk. Martin Luther, William Tyndale, Antonio Brucioli och Francisco de Enzinas använde sig av dem när de översatte Nya testamentet till tyska, engelska, italienska respektive spanska.

Erasmus levde i en period med omvälvande religiösa strömningar, och hans grekiska utgåva av Nya testamentet blev en ovärderlig hjälp för de protestantiska reformatorerna. Han sågs som en reformator ända fram tills reformationen kom i gång på fullt allvar. Vid den tiden vägrade han att välja parti och ställde sig neutral i de teologiska debatter som följde. Över hundra år senare konstaterade David Schaff att Erasmus ”dog ensam och utan att stå på någons sida. Katolikerna ville inte veta av honom, och protestanterna kunde inte ta emot honom.”